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甲基化分析方法的优缺点对比
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-12-03 16:02
由于表观遗传学研究的进展及表观遗传学变化与几种非传染性疾病的相关性，可靠定量的DNA甲基化谱式分析越来越重要。在过去30年，研究DNA甲基化改变的技术在稳步的发展，其研究方法也从最初忽略局部改变的全局DNA甲基化研究发展到了针对某个特定基因或基因组区域的可靠定量化的甲基化分析，包括目前在全基因组尺度具有CpG分辨率水平解析DNA甲基化变化的研究方法也变得逐渐成熟。特别是近几年随着测序技术的爆发式发展，极大的降低了基于DNA测序技术甲基化研究的成本，这使对DNA甲基化的研究在世界范围内的实验室变得越来越流行。可以预见，在不远的将来随着测序成本的进一步降低，对全基因组所有的CpG位点进行分析会变得可行。
表：甲基化分析方法的优缺点对比
| 类别 | 方法描述 | 优点 | 缺点 |
| 全局甲基化分析 | 放射性标记甲基基团 | 廉价；能全覆盖CpG位点 | 不适合用来研究局部甲基化；要放射性标记 |
| 甲基化敏感差异的限制性酶切 | 廉价；非放射性；最基本的实验硬件条件 | 不适合用来研究局部甲基化；不能完全覆盖CpG位点 | |
| 甲基胞嘧啶结合蛋白富集结合荧光定量 | 非放射性；能全覆盖CpG位点 | 不适合用来研究局部甲基化；要求的硬件和抗体比较贵 | |
| HPLC检测 | 非放射性；能全覆盖CpG位点 | 不适合用来研究局部甲基化；要求的硬件比较贵；仪器要求非常高级的专业知识 | |
| 重复序列检测DNA甲基化 | 非放射性；最基本的实验硬件条件 | 不适合用来研究局部甲基化；不能完全覆盖CpG位点 | |
| LC-MS/MS | 非放射性；样本需求量小 | 要求特殊仪器并需要非常高级的培训 | |
| ELISA | 非放射性；最基本的实验硬件条件 | 特异性要求和抗体成本较高 | |
| 生物素-SA-HRP介导的显色反应 | 非放射性；样本需求量小 | 需要生物素标记dNTPs；需要磁珠 | |
| 基因组尺度的甲基化 | 甲基化敏感差异的限制性酶切结合PCR扩增 | 非放射性；最基本的实验硬件条件 | 覆盖有限的CpG位点 |
| 甲基化敏感差异的限制性酶切结合Souther杂交 | 最基本的实验硬件条件 | 杂交需要放射性标记；覆盖有限的CpG位点 | |
| 亚硫酸盐测序 | 最基本的实验硬件条件；不依赖于限制性酶切，分辨率达到CpG水平 | 盐硫酸盐处理容易出现一串T，引物不好设计；测序信号不能定量 | |
| 亚硫酸盐处理结合限制性酶切后PCR扩增（COBRA） | 方法简单，最基本的实验硬件条件 | 引物设计有时候较难；只能覆盖限制性酶切识别的CpG位点 | |
| 亚硫酸盐处理，亚克隆，测序 | 最基本的实验硬件条件；分辨率达到CpG水平；测序峰图清晰 | 引物设计有时候较难；挑取的克隆多，要求数据统计分析能力强 | |
| 亚硫酸盐处理，稀释，PCR（数字亚硫酸测序法） | 最基本的实验硬件条件；分辨率达到CpG水平；测序峰图清晰 | 引物设计有时候较难； | |
| 亚硫酸盐处理，焦磷酸测序 | 辨率达到CpG水平；测序峰图清晰；可以定量 | 扩增片段有限；引物设计有时候较难 | |
| 亚硫酸盐处理，质谱鉴定 | 不依赖于限制性位点；分析片段比焦磷酸测序大 | 引物设计有时候较难；硬件昂贵；仪器要求非常高级的专业知识 | |
| COLD-PCR | 非放射性；最基本的实验硬件条件 | 只能覆盖限制性酶切识别的CpG位点 | |
| 电泳分离 | 非放射性；最基本的实验硬件条件 | 需要变型梯度胶，费时间和人工 | |
| 生物素-SA-HRP介导的显色反应 | 非放射性；样本需求量小 | 需要生物素标记dNTPs；需要磁珠 | |
| 甲基化敏感差异性酶切结合内部甲基化位点扩增 | 最基本的实验硬件条件；在全基因组尺度检测 | 不是表观遗传组学研究方法，但确实可以检测表观遗传差异；只能覆盖有限的CpG位点 | |
| HELP介导deHpaII小片段富集。富集通过甲基化敏感性差异酶切获得 | 最基本的实验硬件条件；在全基因组尺度检测 | 不是表观遗传组学研究方法，但确实可以检测表观遗传差异；只能覆盖有限的CpG位点 | |
| 甲基化DNA沉淀结合微阵列芯片技术（MeDIP-Chip） | 在全基因组尺度检测；不依赖限制性位点 | 抗体和微阵列需求的仪器昂贵；数据量依赖于生物信息学知识；分辨率 | |
| McrBC去除甲基化DNA然后和芯片杂交 | 在全基因组尺度检测；不依赖限制性位点，McrBC可以作用所有的甲基化胞嘧啶，覆盖范围广 | 芯片杂交要求的设备昂贵；数据量依赖于生物信息学知识 | |
| Infinium HumanMethylation27 Bead人甲基化芯片。亚硫酸盐处理检测目的CpG的C/T SNP | 在全基因组尺度检测；在人中有效检测和生物学时间相关区域的甲基化 | 芯片杂交要求的设备昂贵；芯片限于人的样本；只能覆盖有限的CpG位点；数据量依赖于生物信息学知识 | |
| 甲基化DNA免疫沉淀并测序（MeDIP-Seq） | 在全基因组尺度检测；分辨率达到CpG水平；不依赖限制性位点，覆盖范围广；样本被富集过，导致测序成本低； | 抗体特异性要求高；测序成本高；数据量依赖于生物信息学知识；对于区分甲基化区域来说，和同等方法相比不够强大 | |
| 甲基化DNA用甲基结合蛋白MeCP2捕获并测序（MethylCapseq） | 在全基因组尺度检测；分辨率达到CpG水平；不依赖限制性位点，覆盖范围广；样本被富集过，导致测序成本低； | 抗体特异性要求高；测序成本高；数据量依赖于生物信息学知识 | |
| RRBS（Reduced Representation Bisuphite Sequencing） | 在全基因组尺度检测；分辨率达到CpG水平；不依赖限制性位点；样本被精简过，导致测序成本低； | 测序成本高；数据量依赖于生物信息学知识；对甲基化CpG覆盖程度有限 | |
| 亚硫酸盐处理并结合深度测序 | 在全基因组尺度检测；分辨率达到CpG水平；不依赖限制性位点；可以直接定量分析CpG位点的甲基化 | 测序成本高；数据量依赖于生物信息学知识 | |
| 单分子实时测序（SMART） | 在全基因组尺度检测；分辨率达到CpG水平；不依赖限制性位点；可以直接定量分析CpG位点的甲基化；不需要亚硫酸盐处理 | 测序成本高；数据量依赖于生物信息学知识 | |
| HumanMethylation45芯片 和VeraCode甲基化分析平台 | HumanMethylation45芯片 和VeraCode甲基化分析平台 | HumanMethylation45芯片 和VeraCode甲基化分析平台 | |
| DNA甲基化动力学 | 不需要亚硫酸盐处理检测额5fC | 非放射性；基于PCR和NGS | 化学标记效率不高；实验需要高技巧 |
| 甲基化辅助的亚硫酸盐测序（MAB-seq）和精简的MAB-seq（RRMAB-seq） | 在单碱基分辨率水平检测5fC和5caC | 依赖于DNA甲基化反应；成本高 | |
| Aba-seq | 在基因组尺度单碱基分辨率水平检测5hmC；兼容单细胞检测 | 基于5hmC葡萄糖基化的效率 |
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