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简述外泌体及其蛋白质组学研究
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-11-29 11:59
外泌体是什么？
外泌体（Exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-200 nm。外泌体存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，不同组织来源的外泌体在内容物组成和功能方面存在差异，这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。对外泌体的分析和检测可以辅助疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析。
外泌体都有哪些分离提取方法？
对于外泌体研究，分离和收集外泌体是非常关键的一步。目前对于外泌体收集有：超高速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀等几种主要方法，各种方法均存在不同优缺点。
表1 各种分离方法优缺点比较
| 外泌体分离方法 | 操作 | 耗时 | 产量 | 纯度 | 完整性 |
| 超速离心法 | 简便 | 长 | 低 | 高 | 较差 |
| 密度梯度离心法 | 复杂 | 长 | 低 | 高 | 好 |
| 磁珠免疫分离法 | 简便 | 短 | 低 | 低 | 好 |
| 超滤法 | 简便 | 短 | 低 | 低 | 好 |
| PEG沉淀法 | 简便 | 短 | 高 | 低 | 好 |
但是嘞，大牛们的 CNS文章大多用的都是超速离心的方法，不信你看：
表2 CNS文章外泌体提取方法之——惊鸿一瞥
| 杂志 | 文献 | 年份 | 作者 | 外泌体提取方法 |
| Cell | An Actin Network Dispatches Ciliary GPCRs into Extracellular Vesicles to Modulate Signaling. | 2017 | Nager AR et al. | 超速离心 |
| Cell | Acquisition of Phage Sensitivity by Bacteria through Exchange of Phage Receptors. | 2017 | Tzipilevich E et al. | 超速离心 |
| Cell | Exosome RNA Unshielding Couples Stromal Activation to Pattern Recognition Receptor Signaling in Cancer. | 2017 | Nabet BY et al. | 超速离心 |
| Cell | Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. | 2017 | Ying W et al. | 超速离心 |
| Cell | Retrovirus-like Gag Protein Arc1 Binds RNA and Traffics across Synaptic Boutons. | 2018 | Ashley J et al. | 重水蔗糖垫超速离心 |
| Nature | Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. | 2015 | Hoshino A et al. | 超速离心 |
| Nature | Designed proteins induce the formation of nanocage-containing extracellular vesicles. | 2016 | Votteler J et al. | 超速离心 |
| Nature | Hypothalamic stem cells control ageing speed partly through exosomal miRNAs. | 2017 | Zhang Y et al. | 超速离心 |
| Nature | Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer. | 2017 | Kamerkar S et al. | 超速离心 |
| Nature | Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. | 2017 | Thomou T et al. | 超速离心 |
| Science | Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. | 2008 | Trajkovic K et al. |
超速离心& 蔗糖密度梯度离心 |
| Science | Gene-microbiota interactions contribute to the pathogenesis of inflammatory bowel disease. | 2016 | Chu H et al. | 超速离心 |
怎么知道提取的外泌体合不合格？
鉴定外泌体提取合格与否有三大法宝：电镜、NTA粒径、Western blot检测
目前外泌体的分离提取还没有到达炉火纯青的地步，几乎没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。所以提取的外泌体需要通过三大法宝来相互佐证：形态学鉴定（电子显微镜技术）、NTA粒径分析以及Western blot检测标志蛋白（常用的有CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等）。电镜可以观察样品中是否有与外泌体相似的经典结构，有经典结构说明样品中有外泌体或者与外泌体类似的，如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构。WB检测发现样品中具有外泌体的标志物，可以一定程度上排除溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况，但依旧不知道样品的整体情况。因为电镜和WB的连用只能证明样品中有外泌体，但是有多少、纯度等就不得而知了。所以这个时候需要再来一个NTA实验，NTA粒径分析可以反应外泌体样品中粒子的群体特征，以达到跟电镜和WB相辅相成的作用。
图1 Characterization of C666‐1, NP69 and NP460 exosomes.
（引自Chan, Yuk‐Kit, Zhang H, Liu P, et al. Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins[J]. International Journal of Cancer, 2015, 137(8):1830-1841.）
外泌体蛋白质组学研究，有啥好期待的嘞：
外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能，激活细胞信号通路，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。而其中蛋白质的差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点，是研究外泌体起源的重要途径。蛋白质组学已经逐渐成为研究各种亚细胞组分蛋白质组的重要工具。针对外泌体进行蛋白质组学研究，可以揭示疾病发病机制、寻找疾病诊断和预后的生物标志物、筛选疾病治疗靶点等。
废话少说，我们来看看人家具体是怎么运用的吧：
研究目的
鼻咽癌（NPC）是鼻咽上皮常见的恶性肿瘤，在东南亚地区高发，在我国的广东，广西两省尤为普遍。NPC具有高转移率，> 60％的鼻咽癌患者出现颈部淋巴结浸润，5％〜8％的患者出现远端转移。但是NPC转移的机制仍有待阐明。本研究的目的是为了阐明NPC来源的外泌体在肿瘤血管生成中的作用。
实验流程
实验小结
作者利用超速离心法从NPC细胞系C666-1和非肿瘤性NP细胞系（NP69和NP460）培养基中分离外泌体并采用了不同的验证方法来确保外泌体的质量。结果表明，在C666-1外泌体的诱导下，受体内皮细胞在体外显著表达血管生成表型。结合iTRAQ定量蛋白质组学方法以及共聚焦显微镜和Western blot等分析，作者证实了外泌体将血管生成蛋白从NPC转移到受体内皮细胞。表明NPC分泌的外泌体可以在体外诱导血管生成，血管生成蛋白在鼻咽癌细胞分泌的外泌体诱导肿瘤血管生成过程中具有关键作用，可作为潜在的治疗靶标。
外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。金开瑞可提供外泌体研究整体方案设计、外泌体提取/粒径测量/电镜检测、外泌体蛋白组/转录组，助力您的外泌体相关研究。
