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iTRAQ蛋白质组学揭示油菜卷叶机理
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-06-21 11:03
题目：Histological, Physiological, and Comparative Proteomic Analyses Provide Insights into Leaf Rolling in Brassica napus
期刊：Journal of Proteome Research
影响因子：4.268
合作技术：iTRAQ
研究背景
叶片是大多数植物光合作用的主要器官，叶片发育影响作物产量和植物结构。适度的卷叶被认为是作物理想型育种的一个重要组成部分，它能够改变植物的结构，提高光合效率，延缓叶片衰老，减轻干旱、高温和高光等胁迫带来的损害。近年来，在拟南芥和水稻等物种中，已经分离出了卷曲叶片突变体，并对它们的分子机制进行了深入的研究。油菜作为世界上最重要的油料作物之一，虽然也发现了一些卷曲叶片的突变体，但是对于其作用机制仍有待进一步的研究。
本文作者主要利用iTRAQ定量蛋白质组学技术分析油菜卷叶突变株Bndcl1与野生株（WT）的差异蛋白，阐明了卷叶机理及其对植物的生理影响，有望促进油菜的理想株型育种。
研究内容及结果
1. 本研究中，作者选取了油菜卷叶突变株Bndcl1，首先经组织学对比发现，相比于野生株（WT），突变株（Bndcl1）幼苗期的叶片表型上比较紧凑（图 1A和B）。组织切片结果中发现Bndcl1叶绿体数目明显增多，特别是在海绵状的叶肉细胞中(图1C和D)。此外，作者发现，在Bndcl1突变体中，在远轴端韧皮部组织细胞较少，而在其叶脉以下的远轴端表皮细胞明显增大(图1E和F)。
图1.叶片的组织学分析
2. 为了评估卷曲叶片对Bndcl1突变株光合性能的影响，作者测定了Chl的含量、Chl荧光和气体交换参数。与野生株相比，Bndcl1株中的叶绿体数量、PSII和净光合速率的有效量子产量显著增加。
3. 活性氧(ROS)的生成在光合作用的光反应过程中是不可避免的，PSII极易受到光破坏的影响。光抑制的光合作用不可避免的损失会因ROS的产生而加剧，而ROS的产生会减慢PSII的修复。为了减少光氧化伤害，光合生物体已经进化出多种机制，而对抗氧化剂的上调是调节机制的一部分。因此，作者检测了Bndcl1和WT叶子的酶活性、脂质过氧化和ROS水平，发现在Bndcl1叶片中O2• − 和H2O2较低，由此说明其ROS水平也将明显降低(图2A和B)。此外，TBARS在突变株的低水平同样说明其膜脂过氧化的水平降低(图2C)。作者还检测比较了两者的SOD、POD和CAT酶活性，发现相比于WT株，在Bndcl1叶片中此酶活性显著增加。由此说明Bndcl1的光系统能更好的避免受到光氧化伤害。
图2. 野生株（WT）和突变株（Bndcl1）的叶子酶活性、脂质过氧化和ROS水平
4. 作者应用iTRAQ定量蛋白质组学技术研究Bndcl1与WT叶片蛋白质表达水平的差异，总共鉴定到5019个蛋白，差异蛋白有943个，其中发生上调的蛋白有451个，发生下调的蛋白有492个。作者对这些蛋白进行了GO、COG、KEGG等注释分析。通过对差异蛋白中发生上调和下调的蛋白分别进行GO分析并对比发现，在“细胞增殖”、“生物过程的调节”、“色素沉着”等功能方面，下调的蛋白数目要比上调的蛋白数多，具有抗氧化活性的功能的上调蛋白数目是下调蛋白数目的3倍多（图3）。COG分析表明，大多数下调蛋白参与翻译、核糖体结构和生物发生，而上调蛋白主要参与碳水化合物的运输和代谢、转录翻译后修饰、蛋白质的周转、分子伴侣和能量的产生和转化（图4）。KEGG 注释结果显示，尽管在“代谢途径”、“次生代谢产物的生物合成”和“淀粉和蔗糖代谢”中均有上调和下调的蛋白质参与，但在不同的途径中也涉及到不同差异蛋白质（图5）。
图3.差异表达蛋白的GO功能注释分析
图4. 差异表达蛋白的COG注释分析
图5. 差异表达蛋白的KEGG富集分析
5. 为了进一步对这些差异蛋白的功能进行分类分析，作者进行了功能富集分析。通过对差异蛋白的富集分析结果发现，这些发生上调的蛋白能够改善Bndcl1株的光合性能和减轻氧化伤害，并且发现下调的蛋白参与了叶片近-远轴极性建成。
6. 作者最后从差异表达蛋白中挑选了多个蛋白进行了qRT-PCR表达验证。例如：与卷叶表型相关的基因PGY1, PGY2, PGY3, AE5, STV1 and SGS3，这几个基因的蛋白表达水平在蛋白质组学结果是显著下调。qRT-PCR验证结果显示，在Bndcl1株，这些基因mRNA表达水平显著降低，表明这些基因在蛋白质和mRNA水平上发生了一致的变化（图6A）。另外作者从转录水平上检测了叶极性的关键调节因子：AS1, AS2, KAN1, KAN2, REV, RDR6, AGO7, AGO1(图6B)。结果发现在Bndcl1株，AS1, KAN2发生了显著降低，AS2, KAN1没有显著变化，REV发生了显著下调。此外，RDR6, AGO7, AGO1也同样发生了显著下调。最后作者还对油菜甾醇相关的6个差异蛋白进行了转录水平的验证，结果与iTRAQ数据（图6C）一致，说明了定量蛋白质组学分析所获得的结果的可靠性。
图6. qRT-PCR验证分析
文章小结
这项结果研究表明，叶片近-远轴极性和油菜甾醇代谢及信号通路的缺陷是导致Bndcl1突变株叶子向下卷曲表型的原因，叶片的适度卷曲能够提高光吸收、能量转移和CO2固定效率，进而提高了突变株的光合性能。此外，在突变株中，参与PSII修复周期的抗氧化剂和蛋白质水平的升高可能会减少非生物胁迫的光合损失。这项研究为油菜卷叶机制及卷叶对植物生理的影响提供了新的见解。因此，卷叶突变株因具有紧凑的结构，能提高光合效率和增强抗逆性，这也是作物育种理想株型。
解析文献
Wenjing Chen, Shubei Wan, et al. Histological, Physiological, and Comparative Proteomic Analyses Provide Insights into Leaf Rolling in Brassica napus. 2018, DOI: 10.1021/acs.jproteome.7b00744
参考文献
1. Yang, C.; Xu, L.; et al. iTRAQ-based proteomics of sunflower cultivars differing in resistance to parasitic weed Orobanche cumana. Proteomics 2017, 17, 1700009.
2. Liang, J.; Liu, B.; et al. Genetic variation and divergence of genes involved in leaf adaxial-abaxial polarity establishment in Brassica rapa. Front. Plant Sci. 2016, 7, 94.
3. Husbands, A. Y.; Benkovics, A. H.; et al. The ASYMMETRIC LEAVES complex employs multiple modes of regulation to affect adaxial-abaxial patterning and leaf complexity. Plant Cell 2015, 27, 3321-3335.
4. Jia, H.; Shao, M.; et al. Proteome dynamics and physiological responses to short-term salt stress in brassica napus leaves. Plos One 2015, 10, e0144808.
5. Yamaguchi, T.; Nukazuka, A.; Tsukaya, H. Leaf adaxial-abaxial polarity specification and lamina
outgrowth: Evolution and development. Plant Cell Physiol. 2012, 53, 1180-1194.
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