一、酵母单杂交
酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。
二、酵母双杂交
酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测蛋白质相互作用的研究方法，因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点，现已被应用于多个研究领域。
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核蛋白酵母双杂交：
核蛋白酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
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膜蛋白酵母双杂交：
DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）进行蛋白质相互作用的筛选；泛素作为降解信号分子，人为分成两部分：N端（Nub），C端（Cub），互补重构的完整泛素分子可被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。
植物：自交不亲和机理研究……
病毒：朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选……
信号通路：转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选……
癌症医学：癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选……
寄生虫医学：毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选……
基础原理研究：肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育……
一站式辅助检测手段方便快捷，得到可靠的实验结论；
多年文库构建经验，4种优化的Total RNA提取技术方案可以有效保证Total RNA的纯度和完整性，保证样本的多样性；
| 文库质量保证措施 | ||
|---|---|---|
| RNA质量 | 总RNA提取方案-TRIZOL | 适用细胞或者动物组织 |
| 总RNA提取方案-CTAB | 适用植物样本中RNA含量超低的样本 | |
| 总RNA提取方案-SDS | 适用淀粉含量高的样本 | |
| 总RNA提取方案-试剂盒 | 适用多糖多酚含量高的样本 | |
高效的SM定向三框文库构建技术可以保证文库的阳性率在98%以上，且一份cDNA样本连接三个不同的读码框载体可以轻松实现三框文库的质控指标零差异，减少文库差异对筛选结果的影响；
定向改造了pPR3-N系列载体为pPR3-GW载体，可以轻松实现核蛋白文库到膜蛋白文库的一步LR反应，获得膜蛋白酵母双杂交文库。
| 实验步骤 | 三种文库构建策略比较 | ||
|---|---|---|---|
| Clontech的SMART技术 | invitrogene技术 | 专利的三框文库技术 | |
| 双链cDNA的纯化方法 | Spin400纯化柱子 | invitrogene DNA分子筛纯化柱 | 改进的Spin1000纯化柱子，兼顾了片段长度的同时保证样本的回收率在80%左右，有效保证了文库的滴度 |
| 双链cDNA与载体的连接 | 利用酵母体内同源重组酶完成同源重组 | gateway方法 | 专利的三框文库构建策略在原始商业化载体pGADT7和pPR3-N系列载体的基础上改造了Sfi I和Smal I的酶切位点，用于零背景定向克隆目标cDNA片段。 |
| 文库的交付形式 | 转化到酵母细胞的文库菌 | 转化到大肠杆菌的文库菌和文库质粒 | 转化到大肠杆菌的文库菌和文库质粒 |
| 文库的用途 | 改变筛选方案之后可以实现文库的多用途 | 可以方便的通过一步LR反应实现文库的多用途 | 可以通过简单的载体改造构建到任意想要的载体上 |
| 文库的阳性率 | 90%左右 | 90%左右 | 98%以上 |
| 文库的插入片段 | 800bp以上 | 1000bp左右 | 1200bp左右的集中分布 |
酵母单/双杂交文库构建
酵母单杂交文库筛选
酵母双杂交文库筛选
酵母单杂交
| 服务项目 | 客户提供 | 最终交付 |
|---|---|---|
| 文库构建 | 组织/细胞 | 滴度在1×108以上的酵母文库菌液； 文库PCR鉴定结果图片（阳性率在80%左右） |
| 文库筛选 | promoter基因序列/质粒 | 筛选过程中的全部原始图片； 筛选获得所有相互作用的猎物蛋白的测序结果 |
针对酵母单杂交实验结果，可作进一步验证：
| 服务项目 | 实验目的 | 细分 | 周期（工作日） |
|---|---|---|---|
| EMSA | 验证启动子和蛋白互作 | 探针合成及标记 | 10 |
| EMSA实验 | 20 | ||
| 双萤光素梅检测 | 验证启动子和蛋白互作 | 载体构建 | 10-15 |
| 双萤光素酶检测 | 25 |
注：1. 双萤光素酶检测默认使用293T细胞，使用其他细胞视培养及转染难度议价；
2. 双萤光素酶检测启动子-转录因子验证默认1个转录因子 + 启动子序列WT和Mut各1个；microRNA靶基因验证默认1个microRNA + 靶序列WT和Mut各1个，超过以上组合数量请询价。
酵母双杂交
| 服务项目 | 客户提供 | 最终交付 |
|---|---|---|
| 文库构建 | 组织/细胞 | 滴度在1×108以上的酵母文库菌液； 文库PCR鉴定结果图片（阳性率在90%左右） |
| 文库筛选 | 蛋白序列/基因序列/质粒 | 筛选过程中的全部原始图片； 筛选获得所有相互作用的猎物蛋白的测序结果 |
针对酵母双杂交实验结果，可作进一步验证：
| 服务项目 | 实验目的 | 细分 | 周期（工作日） |
|---|---|---|---|
| Co-IP | 验证蛋白互作 | / | 20 |
| GST pull-down | 验证蛋白互作 | GST pull-down+WB/银染 | 20 |
文库构建质控结果：
从质控的结果上看，文库的插入片段分布在1500bp左右，阳性率为100%
高效的一步文库筛选结果：
从文库筛选质控结果上看，筛选到的阳性克隆片段大小不一，插入片段分布在800~1500bp。
从验证结果上看，筛选到的阳性克隆与目的蛋白存在强的相互作用，说明筛选到的克隆确实为互作蛋白。
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