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菌落PCR步骤详解及注意事项
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2022-11-01 10:31
菌落PCR（colony PCR）, 是一种快速、高通量筛选目的片段是否存在的方法，操作起来十分简单。筛选目的是为了得到含有目的片段的菌株进行测序， 提高效率。以大肠杆菌为例，一般来说，在转化了携带外源基因的质粒后，需要检查并确保所设计的质粒确实已经存在于细胞中了；那么，面对一整板的菌落，如何才能知道哪个小细菌携带了目标片段并且是完全准确的目的片段呢？
按照一般的步骤，可以把每个菌落挑出来进行培养提取质粒，然后质粒进行测序或者酶切验证目的片段。但是从培养细菌到最后送测序，花费太多时间。如果说只有一个菌落去验证，那工作量倒不是很大；万一有100个菌落，怎么办呢？那么，我们就可以进行菌落PCR筛选。
基本步骤
1. 单菌落挑取
把LB培养基倒入排枪槽中，然后用排枪加400μL LB培养基到48孔深孔板，用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到48孔深孔板中，同时在48孔深孔板和相应的表单上做好记录，注意对于蓝白斑筛选的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜盖好并做好相应标记（日期、板号等），用针头在封口膜打孔，把它放在37℃摇床上摇一个小时。
2. 菌落PCR反应
配置好PCR反应的反应体系，把配好的反应液加到 96孔反应板中，用排枪加2.5μL的菌液到其中，注意在96孔反应板上做好标记。把96孔反应板放在PCR仪器上盖好橡胶垫，按照PCR反应条件设置反应程序，注意一定要把PCR仪器的盖子盖紧。
3. 琼脂糖凝胶电泳
一般先配置1.0%-1.2%琼脂糖凝胶（即称1.2g的琼脂糖加100ml的TAE），在96孔反应板每个管中加0.5μL的溴酚蓝，震荡均匀，然后点样，电泳好的琼脂糖凝胶拍照，命名保存。
4. 判断阳性克隆并测序
根据琼脂糖凝胶电泳图条带来判断阳性克隆，把阳性克隆的菌液进行扩大培养，进行测序验证，看看是否有完全正确的序列。
注意事项
1. 对于要求筛选出插入片段方向的。
首先我们要大量的挑选阳性克隆，然后根据具体情况，挑选合适的引物配反应液。
2. 怎样来筛选高GC的序列？
如果是GC含量有起伏的序列，可以避开高GC区域来筛选。如果无法避开，首先要选择序列上面的引物，并针对性的变换，使反应条件按照高GC方案来单独上PCR反应。
3.挑斑操作时应该注意什么？
挑斑时枪头深浅要掌握好，菌体尽量多的粘到枪头上，如果斑太小的话最好继续培养一段时间，尽量挑选表面光滑、有光泽、半透明、扁平微凸的斑。
4. 阳性对照和阴性对照在菌落PCR中的好处
阳性对照：筛选某一序列时，加入一个已知含有目的序列的质粒做对照，可以证明反应的体系和反应程序的正确性。如果没有检到条带，可以排除以上因素。
阴性对照：在一管反应体系中刻意的不加模板，结果应该是没有条带。如果出现条带，证明体系中有成分受污染。
5.在查看琼脂糖凝胶电泳图时，发现大小不对的条带，是什么情况，如何来解决？
一般有如下几种情况及解决方案：
①如果是用载体引物来进行PCR扩增，可能是空载体，引物产生了错配，用来做克隆的PCR产物大小不对。
解决方案：如果是空载体，重新酶切载体再次进行连接转化；如果是引物错配，对序列进行分析，换一对合适的引物；如果PCR产物大小不对，重新进行PCR扩增，用正确大小的产物进行连接转化。
②如果是用序列上面的引物来进行PCR扩增，可能原因是引物错配，用来做克隆的PCR产物有缺失或者多一段。
解决方案：如果是引物错配，对序列进行分析，换一对合适的引物；如果PCR产物有缺失或者多一段，重新进行PCR扩增，用正确大小的产物进行连接转化。
③电泳跑胶问题，在用不同的染料进行电泳时，有时候对量没有把握好，很容易出现这种问题。
解决方案：跑完PCR的反应液，重新加合适比例的染料，来进行琼脂糖凝胶电泳。
6. 在查看琼脂糖凝胶电泳图时，发现没有带，是什么原因，如何来解决？
通常有以下几种情况及解决方案：
①配置的PCR反应体系有问题
解决方案：首先检查下筛选用的引物是否正确，再通过阳性对照来检验下整个体系是否有问题，重新配置反应体系来筛选。
②序列有结构导致无带，比如高GC、发夹结构
解决方案：在确保反应体系没有问题的前提下，可以挑选几个无带的克隆进行培养，抽提质粒，选择合适位点进行酶切验证。
③空载体的情况下，用序列上面的引物进行筛选，也是无带
解决方案：用载体上面的引物再进行一次筛选，来确定是否为空载体，同时重切载体，进行连接转化。
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