苄基异喹啉生物碱 (BIA) 是植物中的一组多样化的含氮次级代谢物，仅存在于有限的植物科。具有药理意义，典型的药用 BIA 包括吗啡和可待因（麻醉性镇痛剂）、血根碱和小檗碱（抗微生物剂）、筒箭毒碱和罂粟碱（肌肉松弛剂）以及诺卡品（止咳剂和抗癌剂）。然而，人们对BIA的生物合成和调控知之甚少，本文章表明荷花两个III组WRKY转录因子(TFs)，NnWRKY70a和NnWRKY70b，正向调控荷花中BIA的生物合成。且两种 NnWRKY70 都对茉莉酸 (JA) 有反应，它们的表达谱与 BIA 浓度和 BIA 通路基因表达高度相关。为 WRKY TF 在次级代谢物生物合成中的调节作用提供了有用的见解。

3.1 荷花WRKY70s的核苷酸和蛋白质序列特征比较

     两个 NnWRKY70s和其他先前表征的参与植物次生代谢调节的 WRKY 进行系统发育分析。NnWRKY70a和NnWRKY70b 与参与调节拟南芥，长春花和短冬青的 MIA 生物合成的AtWRKY70，CrWRKY1和OpWRKY1序列相似性很高（A）。且WRKY 结构域中都包含一个核心七肽WRKYGQK和一个保守的锌指基序 CX₇CX₂₃HXC（B）。表明NnWRKY70a 和NnWRKY70b 都是典型 III 组 WRKY 蛋白。

3.2 NnWRKY70s 的表达谱和亚细胞定位

通过实时定量PCR对NnWRKY70 s在不同荷花器官中的空间表达谱进行了判定，其中NnWRKY70b主要在莲藕中表达，其次是根茎和叶，NnWRKY70a在荷叶中表达（A）。而针对荷叶不同发育阶段 (S1-S7) ，两个NnWRKY70基因表现出非常相似的表达模式，在整个测试的发育阶段都持续增加（B）。将NnWRKY70s的编码区与GFP报告基因融合在本氏烟草中过表达来进行亚细胞定位分析, 表明 NnWRKY70a和NnWRKY70b 蛋白都有明显的核定位（C）。

3.3  NnWRKY70 是反式激活 BIA 通路基因启动子的 JA 响应 TF

已知 JA 通过激活 JA 响应性 TF 来触发大多数导致次级代谢物的生物合成途径，为了验证NnWRKY70是否对 JA 有反应，通过检测它们在MeJA 处理后的样本中的表达，结果显示表达量在24h时增加了约5倍（A）；为了寻找NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 启动 BIA 生物合成的启动子区域，通过双荧光素酶实验对筛选的NnTYDC1、NnCYP80G和Nn7OMT初步确定，NnWRKY70a 只能激活pNnTYDC1启动子（B），而NnWRKY70b 可以激活pNnTYDC1、pNnCYP80G和pNn7OMT2三个启动子（C）。为进一步确定 NnWRKY70a 和 NnWRKY70b与这些启动子结合位点，将正常启动子与缺失保守区域W-box的启动子进行酵母单杂验证，结果显示NnWRKY70b 与 pNnTYDC1 和 pNnCYP719A 结合，与pNnCYP80G，pNn7OMT弱结合（D），NnWRKY70a 明显与pNnCYP80G，PNnCYP719A结合，与PNnTYDC1和PNn7OMT弱结合，与NnNCS1启动子均未结合。当从这些启动子中去除 W-box 时，它们都没有与 NnWRKY70a 或 NnWRKY70b 结合（D）。表明 NnWRKY70a 或 NnWRKY70b与 BIA 生物合成基因启动子中的 W-box顺式元件特异性结合，从而激活JA 响应性 TF 来触发大多数导致次级代谢物的生物合成途径。

3.4  NnWRKY70s的过表达增强了荷花中的 BIA 积累

为了进一步确定 NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 是否激活荷花中的 BIA 生物合成，通过检测携带过表达载体的农杆菌浸润的花瓣，结果显示增强了荷花花瓣中的 BIA 含量，同时发现NnWRKY70a或NnWRKY70b的过表达显著促进BIA 途径基因NnCYP80G、NnCNMT、Nn7OMT和NnCYP719A的转录，表明两个 NnWRKY70 之间可能存在交互激活能力， NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 都参与了植物中的 BIA生物合成。

3.5  NnWRKY70b 与 NnWRKY70a、NnWRKY53b 和 NnJAZ1 蛋白发生物理相互作用

通过酵母双杂交cDNA文库筛选试验进一步研究NnWRKY70s和其他蛋白质在调节荷花 BIA 生物合成中可能的相互作用。选择调节 BIA 生物合成的更为显著的NnWRKY70b进行研究，由于全长结构显示出强烈的自激活活性，因此将保留WRKY 和锌指结构域的截短区域作为诱饵（A），将筛选得到的阳性结果做进一步的杂交验证，得到NnWRKY70b 与 NnWRKY70a、NnWRKY70b 与 NnWRKY53b 以及 NnWRKY70b与NnJAZ1的互作结果（B），双分子荧光互补 (BiFC) 实验进一步确定它们之间的互作关系。

在该项研究中，作者通过：（1）系统发育分析表明，NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 为典型的可参与植物次生代谢调节的III 组 WRKY蛋白；（2）双荧光素酶和酵母单杂交实验表明，NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 可以特异性结合BIA 途径基因启动子的 W-box顺式元件，从而正向调节荷花 BIA 生物合成，NnWRKY70b 的 BIA 生物合成激活比 NnWRKY70a 更强；（3）酵母双杂交和 BiFC 分析进一步揭示NnWRKY70b通过与在调节荷花 BIA 生物合成中的关键蛋白之间的相互作用，调节荷花 BIA 生物合成。以上的研究结果证明了 NnWRKY70 TFs 在激活荷花中 BIA 的生物合成中的积极调节作用，并为通过基于 TF 的基因工程提高 BIA 产量提供了可行的策略。