百慕大草是一种重要的多年生暖季草坪草种，同时形成地下生长的根状茎和地上生长的匍匐茎，是快速繁殖能力强的克隆植物。根状茎和匍匐茎作为分别生长在地下和地上的两种特殊茎，在许多多年生和克隆植物的越冬和生态入侵中起着重要作用。然而，由于根状茎和匍匐茎很少在单一的植物物种中共存，这两种茎之间的差异在分子水平上尚不清楚。

在本研究中，作者通过iTRAQ比较蛋白质组分析，首次鉴定了百慕大草的根状茎和匍匐茎中228种不同积累的蛋白质种类(DAPs)。我们发现，228个DAPs相互作用，形成蛋白质网络，以调节不同的细胞活性和生化反应。我们还观察到，生长在地下的匍匐茎表现出与地下生长的根状茎类似的生理活性和DAP表达，这表明光可能在匍匐茎和根状茎的分化中发挥重要的调节作用。这些结果增加了我们对植物茎适应不同生长条件的了解。

匍匐茎和根状茎均由百慕大草的基部芽组成。根状茎呈白色和淡黄色，而匍匐茎呈淡绿色（图1A）。虽然根状茎和匍匐茎在节点和节点间都具有相似的植物组织结构，但这两个茎有不同的节点间长度和直径（图1A-C）。显微分析表明，根状茎的横切面细胞比匍匐茎的细胞多（图1D，E），这与节间直径测量结果一致（图1C）。I2-KI染色进一步表明，根状茎积累的淀粉比匍匐茎积累的淀粉更多（图1F，G），与淀粉含量测定结果的一致（图1H）。有趣的是，匍匐茎的可溶性蛋白质含量明显高于匍匐茎，而两个茎的可溶性糖含量相似（图1I，J）。根据观察发现，两个茎显示不同的颜色，匍匐茎的叶绿素和花青素含量显着高于根状茎（图1K，L）。相反，根状茎中的H₂O₂含量几乎是匍匐茎的3倍（图1M）。这些结果共同表明，百慕大草的茎和根茎在形态，解剖结构和生理活动方面有许多差异。

图1 百慕大草品种阳江匍匐茎与根状茎的解剖生理差异

2. 百慕大草匍匐茎与根状茎节间蛋白质组的比较

为了研究百慕大草中匍匐茎与根状茎之间差异的分子机制，进行了iTRAQ蛋白质组学分析，总共鉴定出4416种蛋白质。在根状茎和匍匐茎中，分别有68.2％和63.5％的蛋白质变异系数（CV）值<20％（图2A），定量比较表明，在匍匐茎与根状茎中只有228种蛋白质显着差异积累。而其余4188种蛋白质在两种类型的茎中显示相似的蛋白质丰度（图2B）。DAP的亚细胞定位预测进一步表明，匍匐茎中的DAP主要位于叶绿体，细胞质和高尔基体中，而许多根状茎中的DAP则被预测为细胞壁，质外体和质膜-定位的蛋白质（图2C）。

为了验证iTRAQ定量结果，使用RT-qPCR确定了10个DAP编码基因的表达水平。特别选择了这十个DAP，以代表四种DAP。结果表明，五个基因在根状茎中优先表达，其他五个基因在匍匐茎中高表达（图3A），这与iTRAQ定量结果一致（图3B）。使用针对具有上述不同种类的倍数变化的四种DAP的Western blot分析，包括DAP8（植物色素A，PHYA），DAP91（过氧化氢酶，CAT），DAP152（热休克蛋白70，HSP70）和DAP225（磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，PEPC），以进一步验证iTRAQ定量结果。结果表明，根状茎中PHYA和CAT的蛋白质丰度更高，而HSP70和PEPC蛋白质则优先在匍匐茎中积累（图3C）。

图2 百慕大草品种阳江市匍匐茎和根状茎的蛋白质组比较

图3选定差异蛋白种类的RT-qPCR和Western blot分析

3. 百慕大草匍匐茎与根状茎的差异化生化途径

分别进行GO和KEGG注释以获得DAP的功能信息。GO注释表明228个DAP参与了21个生物学过程，包括代谢，对刺激的反应，定位的建立，信号传导和生物节律。有趣的是，这21个GO类别都包含不同数量的DAP，这表明这些生物学过程可能在两种类型的茎中受到不同的调节。根据获得的DAPs的KEGG注释信息，KOBAS分析进一步显示，匍匐茎与根状茎中有5和7条生化途径显著丰富（图4A，B）。具体来说，匍匐茎DAP在光合作用、光合作用-天线蛋白质、光合用生物中的碳固定和类黄酮生物合成中富集，而在根状茎DAP在淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和过氧化氢代谢中富集（图4A，B ）。

搜索STRING数据库以获得DAP的可能的PPI信息。结果表明，分别有66.9％（85/127）和70.3％（71/101）的DAP可以在匍匐茎和根状茎中形成复杂的PPI网络（图4C，D）。有趣的是，参与光合作用的20个DAP，参与类黄酮生物合成的6个DAP，参与糖酵解的7个DAP，以及参与淀粉和蔗糖代谢的6个DAP都聚集在PPI网络中（图4C，D）。这些结果与KOBAS分析结果相结合，共同暗示了匍匐茎中光合作用和类黄酮的生物合成受到严格调节，而根状茎中糖酵解和淀粉代谢则受到严格调节。

图4 不同积累蛋白质种类的功能富集和蛋白蛋白相互作用分析

由于自然分化的百慕大草匍匐茎和根状茎在生理活动和蛋白质组分布上表现出巨大的差异，我们怀疑生长在地下的匍匐茎是否可能在某些方面表现得像根状茎。为了验证这种怀疑，我们把匍匐茎埋在土壤里，每隔五天对匍匐茎进行取样。有趣的是，埋在土壤中的匍匐茎的颜色逐渐从浅绿色变成白色，同时淀粉的积累越来越明显。。因此，匍匐茎的叶绿素和花青素含量随着时间的推移逐渐下降，而淀粉和过氧化氢含量在处理后5天急剧增加，并保持快速增加率。

进一步分析了土埋匍匐茎中DAP的表达。RT-qPCR和Western blot均表明，随着处理时间的延长，匍匐茎中四种DAP的表达水平逐渐接近根状茎中的相同表达水平。

在本研究中，作者发现127个和101个蛋白质物种分别优先积累在百慕大草匍匐茎和根状茎中。这228个DAPs包括复杂的蛋白质网络，以精细地调节两种特殊茎中的不同细胞活动。具体来说，匍匐茎的光合作用和类黄酮生物合成受到显著调控，根状茎的蔗糖和淀粉代谢受到显著调控。埋在土壤中的匍匐茎表现出与地下生长的根状茎相似的生理活性和DAP表达，这表明光可能在DAP的差异积累和两个茎的分化中起着重要的调控作用。这些结果不仅增加我们对植物茎适应不同生长条件的了解，而且还建议光控制管理可以用来调节百慕大草和其他拥有两种特殊茎的匍匐茎和根状茎的比率。