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超详细！手把手教你做RNA pull down
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-12-03 15:16
在之前的文章中我们已经了解了RNA pull down 实验的原理、应用、案例和注意事项（回顾点这里），今天我们来唠一唠RNA pull down 实验的详细步骤~
RNA pull down 实验步骤
1、构建 RNA 过表达质粒：基因合成 +测序验证；
2、体外转录模板准备：设计含 T7 启动子引物，PCR 扩增得到转录模板；
3、体外转录：以 PCR 产物为模板，体外转录得到目的 RNA；
4、RNA pull down ：通过磁珠 -RNA 探针复合物富集互作的蛋白；
5、银染质检：SDS -PAGE 电泳银染检测富集蛋白的情况 ；
6、质谱鉴定：通过质谱鉴定实验组与对照的差异蛋白；进而筛选可能的互作蛋白。
一、构建RNA过表达质粒
1、首先通过其他手段筛选确定自己感兴趣的 RNA （以 下讲解lncRNA 为 主）；检索数据库找到对应的 RNA 碱基序列；
2、再通过 RACE 扩增是否存在未知序列，由于 lncRNA-RACE 成功率非常低， 尝试扩增后再确定 RNA pull down 使用的序列；
3、确认 RNA pull down 使用的序列后，设计引物全基因合成目RNA 序列， 构建到 pcDNA3.1（载体可以根据其他实验灵活替换）过表达中，并测序验证序列准确性；
4、最后提取过表达质粒备用。
二、体外转录模板准备
实验分组：
实验组：sense 链即目的 RNA 序列
对照组：antisense 链即目的 RNA 互补序列
引物设计方法：
在正向引物前面加入 T7 启动子序列；反向引物不变。
以构建过表达质粒为模板 +设计合成好的引物，扩增得到体外转录模板，琼脂糖凝胶电泳检测扩增 PCR 产物情况，切取目的条带纯化回收备用。
三、体外转录
1、以纯化回收的 PCR 产物作为转录模板，用体外转录试剂盒进行转录得到目的 RNA （含 sense 及antisense 两组）；
2、不同试剂盒转录情况（转录RNA 大小、转录 RNA 量等等）会有所不同。
四、RNA pull down
1、蛋白液提前准备：
优先选择细胞系：pull -down 实验前需要提供对应的细胞系，扩大培养后收集细胞裂解提取总蛋白备用；
组织样品作为备选：动物或者植物组织液氮研磨后超声裂解提取总蛋白备用。由于组织样品需要前处理，且其中包含很多杂质可能会对磁珠富集产生影响，最终影响富集效率导致富集蛋白量较少，进而影响最终鉴定结果。
2、以上体外转录得到的 RNA ，标记生物素后纯化备用；
3、标记生物素 RNA 探针与链霉亲和素磁珠共孵育形成复合物；
4、生物素 RNA 探针 -链霉亲和素磁珠复合物富集蛋白；
5、富集蛋白洗脱保存。
五、银染
电泳→固定→致敏→染色→显色→终止
六、质谱鉴定
RNA pull down 富集蛋白质谱通常选择胶条鉴定。
根据银染结果来选择质谱鉴定的方式：
A、存在肉眼可见差异条带：
切取 sense 实验组泳道中的差异条带进行胶鉴定。当差异条带非常多时，节约质谱费用也可以选择 sense 和 antisense 两组蛋白液分别进行质谱。
B、无肉眼可见差异条带：
将sense 实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定，根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白，进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。
C、存在浓度差异条带：
也将 sense 实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定， 根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白，进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。
七、验证实验
根据 RNA pull -down 质谱鉴定分析结果，筛选与自己研究相关的可能互作蛋白。
购买对应蛋白 IP 级别抗体；或者构建标签重组过表达质粒 /慢病毒处理细胞。使用目的蛋白抗体或者标签进行 RIP -QPCR实验反向验证。
八、直播预告
12月1日（周二）20:00
直播教你做RNA pull down
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