miRNA可以与mRNA结合调节体内基因的表达，通过影响蛋白的表达、修饰、酶活性等来调节生命活动的进行。lncRNA作为体内的ceRNA，可以与miRNA结合起到调节基因表达的作用。研究lncRNA与miRNA的相互作用对于研究生命具有重要的意义。通过MS2-RIP和灵敏度更高的双荧光素酶技术，来研究lncRNA和miRNA的相互作用。
MS2-RIP
MS2-RIP技术主要是应用针对GFP抗体的Protein G磁珠把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。
技术流程
- 载体构建及转染
-
- 细胞裂解液获取
及磁珠的准备
-
- RNA结合蛋白免疫沉淀
-
- RNA纯化
-
- RNA反转录及cDNA验证
-
- 数据分析
案例展示
图. MS2- RIP实验原理图（表达Lnc-A的质粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表达Lnc-A的MS2组明显提高。通过对照，说明MS2-A可以与miRNA1和miRNA2相互结合）
双荧光素酶报告系统
双荧光素酶报告基因通常是一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。金开瑞应用Promega 公司的双荧光素酶报告基因检测(DLR)系统，提供DLR 检测服务。
技术流程
- 序列分析
-
- 合成或者扩增目的片段
亚克隆至目标载体
-
- 报告基因质粒、转录因子共转染细胞
-
- 荧光素酶反应发光
-
- 结果分析
案例展示
图. 双荧光素酶和RIP验证lncRNA可以与miR-26a结合
（引自C Cao, Zhang T, Zhang D. et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. ）
蛋白与核酸的相互作用广泛存在于生命活动的调节中。基因的复制、转录、翻译、修饰等过程都离不开核酸和蛋白的互作。金开瑞提供RNA pull down+质谱、双荧光素酶、染色质免疫共沉淀、凝胶迁移或电泳迁移率检测（EMSA）、酵母单杂交、DNA pull down等技术来检测DNA/RNA与蛋白的相互作用。
RNA pull down
蛋白质与RNA 的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等。金开瑞现提供RNA pull down 检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测，能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且金开瑞配套自己的质谱平台，能显著提升检测效果。
技术流程
- RNA探针标记
-
- 胞浆蛋白提取
-
- 与磁珠结合、洗脱
-
- WB检测或者质谱鉴定
案例展示
图. pull down下来的蛋白银染图
根据胶上条带的差异情况和实验目的，选择质谱或者WB鉴定pull down下来的蛋白
图. SDS-PAGE电泳后质谱鉴定
DNA Pull down
DNA pull down是用于分析蛋白质与DNA互作的一种分析技术。该实验首先需要针对待研究目的基因的调控区域设计并制备特异性探针。同时，制备细胞核提取物；将探针和核提取物共同孵育，DNA结合蛋白就会和靶向序列特异性结合。然后，通过亲和素磁珠纯化蛋白质DNA复合物。最后针对获得的蛋白，使用WB验证或者质谱方式鉴定蛋白质类型。
技术流程
- 采用基因组DNA做模板，经PCR扩增特定片段
-
- 将其克隆至克隆载体，并测序鉴定成功
-
- 使用PCR法或末端标记法标记探针
-
- 标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度
-
- 细胞核物质分离提取与探针孵育
-
- 探针蛋白复合物洗脱与纯化
-
- WB蛋白验证或者质谱鉴定
技术应用
Examples of the liquid chemiluminescent DNA pull-down assay.
(引自Iwasaki T, Miyazaki W, Rokutanda N. et al. Liquid chemiluminescent DNA pull-down assay to measure nuclear receptor-DNA binding in solution. Biotechniques. 2008 Oct;45(4):445-8.)
RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）
RIP（RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。金开瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。
技术流程
- 载体构建及转染
-
- 细胞裂解液获取
-
- 磁珠的准备
-
- RNA结合蛋白免疫沉淀
-
- RNA纯化及鉴定（测序）
案例展示
使用目的蛋白寻找验证RNA（蛋白/RNA互作）
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
ChIP染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
技术流程
- 细胞固定
-
- 染色质断裂
-
- 染色质免疫沉淀
-
- 交联反应的逆转
-
- DNA的纯化
-
- DNA的鉴定
案例展示
A. Rapid increase of histone acetylation in silent genes caused by HDAC inhibitor treatment.
B. The ChIP-Seq signals for the DIPA gene (active) and FOSL1 gene (silent) were displayed.
(引自Wang Z, Zang C, Cui K, et al. Genome-wide mapping of HATs and HDACs reveals distinct functions in active and inactive genes. Cell. 2009 Sep 4;138(5):1019-31.)
凝胶迁移或电泳迁移率检测（EMSA）
凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA 序列相互结合的技术，可用于定性和定量分析。目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用，是转录因子研究的经典方法。金开瑞帮助您检测DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白、特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。
技术流程
- 实验设计
-
- 合成探针
-
- 生物素标记探针
及标记效率检测
-
- EMSA电泳凝胶配置
-
- EMSA反应
-
- 电泳检测
-
- 显色反应
案例展示
The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.
（引自Li M, Yan J, Yan Y. The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochem Biophys Res Commun. 2017 May 20;487(1):173-180.）
酵母单杂交（Y1H）
将提取的样品RNA 逆转录成单链cDNA,经长距离聚合酶链反应扩增得到双链cDNA，再经CHROMA SPIN TE-400 柱子纯化后与酵母表达载体pGADT7-Rec 线性质粒共转至Y1HGold[pBait-AbAi]酵母感受态，经SD/-Leu/AbA 缺陷培养基筛选出与诱饵序列相互作用的猎物蛋白。
技术流程
- 总RNA提取
-
- mRNA分离纯化
-
- cDNA单链的合成融合
-
- cDNA双链的的合成
-
- 双链cDNA的纯化
-
- 线性化pBait-AbAi质粒转化
-
- 单杂交cDNA文库构建及筛选
-
- PCR鉴定蓝斑克隆中插入的cDNA片段
-
- 抽提阳性克隆子prey质粒
-
- 测序及验证
案例展示
图. 酵母单杂原理图
Description of the Y1H screens approach conducted with Zat12 promoter segments as baits.
(引自Ben Daniel BH, Cattan E, Wachtel C, et al. Identification of novel transcriptional regulators of Zat12 using comprehensive yeast one-hybrid screens. Physiol Plant. 2016 Aug;157(4):422-41.)
蛋白是生命活动的执行者，可以以单一分子或者复合体形式执行生命活动。蛋白分子间相互作用是蛋白分子组建复合体、执行功能的一个途径。金开瑞可以提供免疫共沉淀、GST pull down、酵母双杂交技术检测蛋白分子间的相互作用。其中，免疫共沉淀实验结果具有更接近真实生理条件下蛋白相互作用信息的优点，配合GST pull down，可以研究蛋白之间是直接相互作用还是间接相互作用，而酵母双杂对于研究低表达的蛋白、瞬时表达蛋白具有更高灵敏度的优点。
免疫共沉淀 (Co-IP）
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的蛋白一同随免疫复合物沉淀，然后进行检测的技术。通过免疫共沉淀可以检测两种目标蛋白质是否在体内存在相互作用（直接或者间接），免疫共沉淀后通过质谱技术也可以寻找一种蛋白在体内的相互作用蛋白。
技术流程
- 样品准备
-
- 样品裂解、定量
-
- 抗体、proteinA/G凝胶等准备
-
- 沉淀收集、洗涤、制样
-
- WB检测分析
技术运用
Co-IPs were carried out with anti-Tiam1 antibody from the lysates of the different SDC4 lines and the subsequent immunoblot was probed with anti-GFP-HRP (GFP::SDC4) or anti-Rac1 antisera, respectively. Tiam1,Rac1 and GFP::SDC4 were used as loading controls. The strongest interactions were detected in the Ser179Glu and ΔPDZ-Ser179Glu cell.
（引自Keller-Pinter A, Ughy B, Domoki M,et al. The phosphomimetic mutation of syndecan-4 binds and inhibits Tiam1 modulating Rac1 activity in PDZ interaction-dependent manner. PLoS One. 2017 Nov 9;12(11):e0187094.）
GST融合蛋白沉降（GST pull down）
Pull down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
技术流程
- GST探针蛋白（互作蛋白）载体构建
-
- 融合蛋白（互作蛋白）表达
-
- 探针琼脂树脂孵育
-
- Pulldown实验
-
- 互作蛋白鉴定
技术应用
GST pulldown assays were performed by incubating purified NF110a with GST, GST-APH-2 or GST-HBZ immobilised on GST resin. The eluates were analysed by immunoblot with anti-ILF-3 antibodies (left panel) and coomassie blue staining (right panel). NF110a input corresponds to 20% of total NF110a loaded to each pulldown.
（引自Murphy J, Hall WW, Ratner L, Sheehy N. Novel interactions between the HTLV antisense proteins HBZ and APH-2 and the NFAR protein family: Implications for the HTLV lifecycles. Virology. 2016 Jul;494:129-42.）
酵母双杂交（Y2H）
酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
技术流程
- 接收订单及样品
-
- 总RNA提取
-
- mRNA纯化
-
- 反转录
-
- 双链cDNA合成及纯化
-
- 共转至酵母感受态细胞
-
- 转化效率测定
-
- 文库效价测定
-
- 结果交付
案例展示
图. 酵母双杂原理图
Identification of 14–3-3γ as a direct binding partner of Best1 in the yeast two-hybrid system.
（引自Oh SJ, Woo J, Lee YS,et al. Direct interaction with 14-3-3γ promotes surface expression of Best1 channel in astrocyte. Mol Brain. 2017 Nov 9;10(1):51.）
AP-SWATH
生物体内的蛋白质很少单独行使功能，蛋白质之间会形成复合物来发挥功能。蛋白质间的相互作用是细胞中最基本的活动，被称为互作蛋白质组（Interactome）。研究蛋白质组相互作用的方法主要有亲和纯化（AP）、化学交联偶联质谱CXMS）等方法。其中AP技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下，能捕捉出特定的蛋白质及其分子伴侣。
技术流程
- 接收订单及样品
-
- 亲和纯化产物
-
- LC-MS/MS
-
- 数据解析
-
- 互作蛋白确定
-
- 结果交付
案例展示
（引自Caron E, Roncagalli R, Hase T, et al. Precise Temporal Profiling of Signaling Complexes in Primary Cells Using SWATH Mass Spectrometry.[J]. Cell Reports, 2017, 18(13):3219）
