实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。

取材后新鲜组织须于-80℃保存，干冰运输。动物组织＞100mg，细胞数＞106，植物组织＞0.5g、幼嫩组织为宜，预计可以检测4个指标，避免反复冻融。当检测基因数较多时样品量须随之增加。

Real-time qPCR通过荧光信号在每个反应循环终点检测，反应指数增长期，可以真实监测模板起始量，线性范围可达5~7个数量级；而终点法重复性不佳、线性范围较窄，且产物电泳检测受限于片段大小和凝胶分辨率、胶染料灵敏度等因素，线性范围在100-fold左右。

染料法以SYBR Green荧光强度的大小为指标来检测DNA的扩增，不需探针法中设计合成荧光标记探针，因此染料法实验周期及成本都得以降低。染料法可能会检测出引物二聚体等非特异扩增产物，需要通过进行融解曲线分析来确认反应产物是否特异性扩增，同时在引物设计及反应条件方面都需注意优化。探针法相对较易保证反应特性，但在检测灵敏度方面同染料法并无高低之分。金开瑞默认使用染料法。

相对定量用于测定实验组样本中目的序列拷贝数相对于对照组样本中目的序列拷贝数的变化倍数，比较各组样本间的Ct值；

绝对定量测定待测样本中目的序列拷贝数的数量，需要通过标准品绘制标准曲线。

金开瑞使用的是特异性更高的颈环法引物设计。行使功能的microRNA成熟形式一般仅18~25nt，因此在逆转录环节通过特定引物增加其长度，以便于qPCR过程正常进行。颈环法中的逆转录引物由自身可形成颈环结构的通用序列加上目的microRNA 3’端碱基的反向互补序列；polyA加尾法即在逆转录前先加polyA尾，然后通过oligo(dT)引物进行逆转录。金开瑞使用颈环法，该方法设计及实验成本均高于加尾法，但在检测灵敏度及特异性方面具有优势。