iTRAQ定量蛋白质组学常见问题与解答
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Q：iTRAQ技术原理是什么？该技术的优势和缺陷分别是什么？
iTRAQ技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ技术的优势：多达8标记、系统误差小、直接对二级谱定量、定量蛋白数量更多、标记效率高等。
iTRAQ技术的缺陷：应该说这是唯一的缺陷，就是定量不是当前定量技术最准确的，最准确的是SWATH和MRM技术。定量不准确的原因是附近m/z同位素的干扰，这些m/z接近的同位素引入了干扰的4标记或8标记的同位素，最终导致原本差异10倍，而干扰会将10倍变成5倍左右。当然，差异蛋白的趋势是正确的，大量发表的研究论文也证实了这一点。
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Q：采用iTRAQ技术对样品有什么要求？iTRAQ技术适用对象有哪些？
iTRAQ对于每一个样品的蛋白需求最少为50μg，采用4标或8标iTRAQ标记进行的iTRAQ实验，一般来说，分析的样品数量不能少于4个，采用8标标记进行的iTRAQ实验其同时分析的样品数量不能多于8个。
理论上说，iTRAQ适合任意来源的总蛋白样本，植物、动物、细菌、真菌等等。
具体样本要求可参考请参考《金开瑞蛋白质组学样品准备注意事项》
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Q：iTRAQ技术一般能鉴定到多少蛋白？
iTRAQ技术一般可以鉴定到3000～5000个蛋白，具体需根据您的样本而定。
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Q：iTRAQ定量蛋白质组做完实验后，能拿到什么结果呢？可以直接用来发文章么？
金开瑞目前的iTRAQ定量蛋白质组的实验流程和结果都是受到业内顶级杂志JPR和MCP公认的，可以直接用于文章的发表。客户不仅可以拿到iTRAQ定量蛋白质组中的差异蛋白、蛋白的GO和KEGG归类信息、COG归类、不同样本的差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作蛋白信息等，还可以提供客户指定的分析内容，提供个性化的服务要求，比如转录组和蛋白质组的关联分析。
目前金开瑞已协助客户发表了百余篇文献，部分可参考http://www.genecreate.cn/Proteomics_analyse/。
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Q：iTRAQ对于生物重复和实验重复有要求吗？一般发的文章都是做几个实验重复和生物重复？
一般建议做3次重复（国际认可）。关于生物学重复和实验重复，如果您想通过蛋白质组学技术，去发现一些现象，我们一般建议做生物重复，因为生物重复实际上已经涵盖了实验重复。如果您希望获得一个比较满意的重复结果，可以做实验重复。
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Q：什么情况下适合用iTRAQ技术，什么情况下适合用lable-free技术？
iTRAQ技术，由于标记后可以提高肽段离子化效率，利于鉴定到更多蛋白质；基于低分子量端来进行定量，定量结果更准确；可以同时完成8个样品的质谱定量分析。 Label-free技术，对样本的操作最少，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。但对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高。由于实验周期以及数据准确度等方面的优势，一般推荐iTRAQ技术。
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Q：iTRAQ、SILAC和SWATH等相比，我更应该选择哪一种定量的方法呢？
目前主流的定量蛋白质组方法有5种，分别是iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、label-free和SWATH 。其中最流行的是iTRAQ定量蛋白质组方法，该方法不依赖样本，可以做任意样本的总蛋白质的差异定量，而且定量准确，这个层次上label-free虽然也可以做任意样本，但是定量准确度难以保障。SILAC是仅仅适合细胞层次的蛋白质组定量，组织的定量需要摸索或者前人已经摸索的模式，中途测试新组织难度较大，极易失败，细胞层次的SILAC培养费用高昂，不适合做商业化。MRM和SWATH都是目标蛋白质组相关的定量模式，但是SWATH可以完成数千种蛋白的定量，准确度极高，通量远高于MRM，对于亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本，SWATH效果非常好，当然，SWATH价格相对较高。SWATH本身对物种没有偏向性，也是目标蛋白定量的一种，定量结果准确，可以和MRM媲美，发文章更具有说服力，但是一次能定量只能达到2000多个蛋白。
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Q：不同老师的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机？
确实有部分商业公司将不同客户的iTRAQ样本放到一起，如此可以有效的节约成本。
但金开瑞的专业决定了我们坚决不会将不同客户的样本混合到一起上质谱。如果客户的样品来自不同物种，那么质谱鉴定的数据库选择会不同，无法进行比较。如果是同一个物种的样品，那么经过不同实验室处理后，样品里的蛋白含量和数目会有较大差别，混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。
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Q：对于iTRAQ下机数据，使用什么软件分析？如何判断差异蛋白？
金开瑞采用与Triple TOF 5600 plus配套的proteinpilot。已经有大量使用该软件发表的蛋白质组相关文献，是一款被广泛认可的蛋白质组鉴定、定量软件。我们对鉴定结果要求FDR≤1%，每个蛋白至少包含1个独有肽段。对于定量差异蛋白的评判标准，我们一般按照FC≥1.5，同时p-value≤0.05的标准过滤。
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Q：两者要有多大的差异，才叫差异蛋白？
差异蛋白是一个相对概念。一般认为当差异倍数达到1.5倍以上（但也有以差异倍数1.3倍或2倍以上），且经统计检验其p-value值小于0.05时，视为差异蛋白。
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Q：为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？
这是学术性的问题，不是技术的问题。表达层次即RNA层次，RNA层次和protein层次的不一致性是一个公认的事实，通常相关性只有～0.5左右，即RNA和protein往往是两个不一样的概念。引起RNA和protein差异的原因很多，比如miRNA、lincRNA、circle RNA和E3 ligase等等。
