常见问题与解答
噬菌体展示技术常见问题与解答
文章来源：原创
作者：genecreate
发布时间：2017-11-01 15:42
1、在噬菌体展示技术的应用中，M13噬菌体与其他噬菌体比有什么优点？
M13噬菌体和与其密切相关的丝状噬菌体fd和f1均为非裂解性噬菌体，它们在增殖期间均不裂解宿主菌。这就极大地简化了每轮淘选过程之间的中间噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。而其他用于噬菌体展示的噬菌体，如T7, T4和Lambda噬菌体，均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以避免淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白。
2、pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?
丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每个病毒子含５个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。而对主要包膜蛋白pVIII来说，每个病毒子含～2700个拷贝之多，其中约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。这样，以pIII融合子方式表达的多肽便是低价的（每个病毒子1~5个拷贝），而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200个拷贝）。这种高价pVIII展示所增加的亲和力／性有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。
3、含与不含前导肽的pIII蛋白各有多大？
未加工的包膜蛋白pIII（含前导肽序列但不含展示肽的pIII蛋白）的分子量为44651 Da。不含前导肽序列的成熟pIII蛋白分子量为42579 Da。
然而，进行SDS-PAGE电泳时，pIII通常跑在分子量60-65 KDa附近，可能是因为该蛋白不同功能域之间含有特殊的甘氨酸富集的间隔区域。前导肽的氨基酸序列是MKKLLFAIPLVVPFYSHS （注意起始甲硫氨酸Met是由密码子GTG编码的）。
4、文库克隆载体可以买到吗？
用来构建所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE，是可以购买到的。M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端构建了限制性酶切位点，用户可以将设计好的人工基因盒（synthetic cassette）插入此处构建自己的肽库。因为M13KE是噬菌体，而不是噬菌粒载体，所以在已加工病毒子上的所有5个拷贝的pIII蛋白均携带有展示肽序列。另外，大于20-30个残基的展示多肽会影响噬菌体的感染力，所以此载体仅适合展示短的多肽，而不能展示大的蛋白分子或cDNA文库。
5、有anti-M13的抗体吗?
市面上有抗-M13的抗体，抗-M13的抗体为多克隆抗体，主要识别pVIII抗原。
6、可以对文库进行扩增以便多做几轮淘选试验吗?
强烈建议不要对产品中所提供的原始文库进行扩增。因为体内序列偏性现象很可能导致某些序列在扩增后的文库中所占比例大大降低，甚至完全缺失。所提供的文库都是在连接后仅扩增了一次，文库所有的特征（代表性的测序数据，淘选数据等）都是在扩增销售贮存液的基础上进行的，一旦进行再扩增，我们便不能保证每种文库中所报道的氨基酸分布数据依然成立。
上一篇：重组抗体的产生及优势有哪些？
