常见问题与解答
慢病毒包装常见问题与解答
文章来源：未知
作者：genecreate
发布时间：2017-05-11 11:36
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- --- 能介绍一下你们公司的慢病毒载体系统吗？
- 答：我们公司的慢病毒载体系统由4质粒系统组成，是在第三代慢病毒载体系统上经过进一步的优化而成。我们对部分载体上的元件进行了改造，从而提高了病毒的感染滴度，并且极大降低了病毒重组的概率，为客户提供更安全高效的病毒。 同时，我们拥有多达9种不同的包膜蛋白，是国内目前拥有最广感染谱系的生物技术服务公司。这些包膜蛋白可以帮助研究人员将目的片段导入脑、血液系统、肝脏等组织。
- --- 贵公司的慢病毒载体可以插入多大的目的片段？
- 答：慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右(还取决于载体本身是否有其他抗性基因或报告基因)。一般而言插入的片段如果在5kb以下产生的病毒滴度比较高，当插入的片段大于6kb的时候得到的病毒滴度往往不高。如果除去一般携带的抗性基因和GFP报告基因，则往往只余下3kb左右的容量供目的片段的插入。但我们可以通过载体改造去除一些不必要基因，在一些特殊情况下，可以最大插入4kb的基因片段。
- --- 你们的慢病毒载体上有什么报告基因？
- 答：目前我们主要提供的报告基因是绿色荧光蛋白zsGreen和红色荧光蛋白RFP的载体系统。我们所选的这两个报告基因的荧光亮度都很高，同时是以单体的形式存在。此外，我们还可以根据客户的需要提供包含其它报告基因(如半乳糖苷酶lacZ或荧光素酶luciferase等)的载体系统。
- --- 我以前用过慢病毒感染造血细胞，但是表达不理想，你们有没有好的解决办法？
- 答：影响慢病毒载体介导的目的蛋白表达的因素主要是病毒的感染能力和特定的启动子在该细胞中的强度。VSV-G介导的慢病毒载体对造血系统的细胞的感染能力并不合适，除了常规用的VSV-G外，我们公司还拥有其它8种病毒包膜蛋白库，我们会根据客户的需要选择特定的包膜蛋白，或者是利用特定的启动子，从而使目的基因能在特定的细胞中得以高表达。
- --- 慢病毒是HIV开发出来的，这会不会比较危险?操作慢病毒的时候需要注意什么？
- 答：我们的慢病毒载体经过了一系列的改造，病毒在感染细胞中并不能自我复制，从而大大降低了其危险性。尤其是我们使用了现在最新型的四质粒包装系统，是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统，至今为止未见重组报道。而大部分其它公司常用的三质粒包装系统陆续出现过重组报道。慢病毒对加热、去垢剂、医用消毒水、福尔马林等均很敏感，但UV照射无法有效灭活。所以所有接触过病毒的器皿或枪头需要84消毒液浸泡半小时后用自来水冲洗 然后丢弃或回收即可。
- --- 如果我想在你们公司制备慢病毒需要提供什么？完成后你们公司最后会提供怎么样的慢病毒？大概花多长时间？
- 答：客户需要提供：(1)含有目标基因的质粒(包括测序图谱)，或目的基因的名称及序列;(2)所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化;(3)实验目的及要求，是否需要对照病毒;我们公司能提供滴度在1×108 TU/ml以上，体积为1 ml的纯化病毒(根据客户需要，不同量有价格差异)。如果是RNAi用的病毒，我们公司将承诺提供能有效抑制目的基因的表达水平70%以上的病毒。一般而言载体构建及准备需要10-15个工作日，病毒包装及扩增需要20-30个工作日，滴度测定需要5-10个工作日，总计需要35-55个工作日。
- --- 你们提供的慢病毒的滴度是如何测定的？这个测定方法如何？我拿到病毒后需要自己测滴度吗？
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答：我们是在293T细胞株中对纯化的慢病毒进行滴度测定的。常用有4种方法进行慢病毒滴度测定，分别是：
(1)通过ELISA对病毒颗粒中的p24蛋白进行检测;
(2)通过定量PCR对病毒颗粒的RNA进行检查;
(3)通过定量PCR对整合到基因组DNA中的病毒序列进行检测;
(4)通过FACS对荧光蛋白的表达水平进行检测。
我们用基因组DNA定量PCR的方法进行慢病毒滴度的检测。前两种方法并不能区分病毒颗粒是否有活性，因此测定所得的滴度往往比后两种方法高一至两个数量级。后两种方法确定的是有效的病毒滴度，因此更有意义。由于并非所有的病毒载体中都含有荧光蛋白，此外，荧光蛋白的表达有时候还受启动子及表达的目的基因影响，因此通过定量PCR法检测整合到基因组中的病毒序列进行检测是最佳方法。
- --- 你们提供的慢病毒我应该怎么保存呢？我能够反复冻融慢病毒吗？
- 答：我们提供的慢病毒可以长期置于-80 °C大概一年左右，其滴度不会有太大的降低。但是如果储存条件不佳，或是放置时间过长，我们建议客户在实验前重新对其滴度进行测定。我们不建议对慢病毒进行反复冻融。一般而言每次冻融都会使慢病毒活性损失5%以上，而且随着冻融次数的增加活性损失更明显。冻融一次后， 如果在一周内使用，可以放置于4 °C。
- --- 如何选择适合我实验目的的病毒包装类型？
- 答：常用的病毒载体特点和主要应用范围请咨询技术支持人员。研究人员需要依据自己具体的实验目的选择合适的病毒载体。我们的研究人员有丰富的病毒研究和使用经验，咨询我们的技术支持团队，您可以获取更多帮助。
- --- 病毒可以高效感染任何靶细胞吗？
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答：理论上，现有的病毒载体可以在任何条件下高效感染任何靶细胞。其依据是，病毒载体高效感染细胞主要受三个参数影响：
1)细胞特性：分裂和非分裂细胞、体内所处环境是否存在血脑屏障等阻碍。现有的病毒载体，综合起来，既可以侵染分裂细胞，也可以侵染非分裂细胞，而且还可以突破血脑屏障高效侵染脑神经细胞。
2)细胞种类：不同组织细胞。虽然不同载体对不同组织细胞的侵染有倾向性，但通过改造病毒载体决定病毒表面糖蛋白的序列，即使针对同一类病毒，也可以获得最高达数百种不同侵染特性的载体系列，从而可以满足不同细胞类型的侵染需求。
3)病毒载体的滴度。 除不同类病毒其滴度会不同外，病毒载体的滴度还受包装片段的特性影响，包括插入片段的毒性和大小。外源片段的毒性可以通过使用诱导调控系统或者改造病毒包装细胞系来减轻毒性影响，而插入片段的大小的影响可以通过选择对外源片段具不同容纳能力的病毒载体来避免。
我们拥有庞大的病毒载体库，可以最广程度地覆盖各种组织细胞，同时可以覆盖不同特性的细胞，还拥有各种诱导表达系统和经过改造的病毒包装细胞系可以包装具有细胞毒性的外源插入片段。
- --- 我们提供的这些病毒产品的安全性如何？
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答：使用病毒载体的危险性主要有以下几个考虑因素：
1)是否能重组产生致病性病毒;
2)是否具备复制能力;
3)是否能整合，并导致癌基因激活或者抑癌基因失活;
4)免疫原性。
我们所使用的病毒载体，全部经过改造，去除了致病性元件和复制功能区，因此重组产生功能性病毒的概率极低。一部分病毒(腺病毒和腺相关病毒载体)，其整合几率低，因此安全性高。同时，针对部分具备整合能力的病毒载体(慢病毒载体)，还去除了其3’LTR内的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。因此，这些病毒载体用于体外和动物实验，对使用者而言都具有极高的安全性。有的病毒载体，比如腺相关病毒载体，即使用于人体，也被认为是安全性非常高的一类基因治疗载体。尽管如此，我们建议，使用病毒载体进行细胞或动物实验时，需要遵循标准废弃病毒载体操作流程。
- --- 如何选择合适的启动子用于体内动物实验？
- 答：部分质粒载体的启动子所含GC含量比较高，所以进入动物体内后，细胞会启动表观遗传学信号通路，对其进行甲基化修饰或者在染色体整合位点进行去乙酰化修饰从而抑制基因的表达。体外细胞的病毒载体转导偶尔发生类似修饰，但比较罕见。所以，针对体内动物实验，尤其是利用病毒载体制备转基因或者基因敲除、 RNA干扰小鼠等，需要选择恰当的启动子才能表达外源插入片段。我们拥有丰富的经验，我们的启动子库可以帮助研究人员选择合适的启动子用于特定的实验。
- --- 什么时候需要使用诱导表达系统？
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答：诱导表达系统无论是对于体外基因功能研究还是体内动物实验，都是非常有用的一套系统，当研究遇到以下情况时，建议使用诱导表达系统：
1)所表达基因或者外源片段具有抑制细胞生长、引起细胞毒性等特性。
2)需要在特定时间开启或关闭外源片段的表达。
- --- 成功构建诱导表达系统的关键是什么？
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答：一个成功的诱导表达系统，需要达到以下效果：
1)对于诱导激活系统来说，需要在未激活前保持很低的表达水平，而激活后，能迅速地高水平并且稳定表达。
2)对于诱导关闭系统来说，需要在关闭前可以维持正常的表达水平，而添加诱导关闭物后，能迅速彻底地关闭基因的表达。
而影响诱导表达系统构建成功的因素主要有以下几点：
1)诱导表达载体自身调控元件：包括启动子的强弱、启动子对诱导物的响应效果、载体启动子外其它调控元件对插入片段表达的影响。解决方案包括使用组合诱导物以达到更佳效果，改造其它调控元件以减少泄露表达。
2)稳定整合位点：由于构建诱导表达系统必须在稳定细胞株中实现，所以，稳定整合位点附近的转录活性对诱导表达系统影响很大。转录活性过低，导致诱导激活效果不佳，转录活性过高，导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。因此需要构建多株稳定细胞株，并进行比较，挑取诱导前后均符合预 期的一株进行实验。
3)稳定整合后拷贝数：拷贝数过高也会导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。所以建议使用逆转录(包括慢病毒)载体获得单拷贝细胞稳定株。
- --- 如何使用病毒液去感染靶细胞？
- 答：不同的重组病毒载体，不同的细胞，以及动物体内组织细胞侵染，其具体的操作步骤都有所不同。所以建议研究人员依据具体的实验选择不同的操作步骤。 我们的细胞侵染库，可以帮助客户选择最佳的病毒载体液去感染靶细胞。
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